1980 کی دہائی کے آخر میں، جیسا کہ ترقی یافتہ تاہم، لیزر کنفوکل مائیکروسکوپی میں ایک بڑا نقص ہے: کنفوکل یپرچر نہ صرف فوکل پوائنٹ کے باہر پیدا ہونے والے فلوروسینس کو روکتا ہے، بلکہ فوکل پوائنٹ سے پیدا ہونے والے فلوروسینس کو بھی روکتا ہے جو حیاتیاتی ٹشوز کے ذریعے بکھرے ہوئے ہیں، فلوروسینس کے جمع کرنے کی کارکردگی میں کمی کے نتیجے میں، اور امیجنگ کی گہرائی 100 مائکرو میٹر سے زیادہ نہیں ہوسکتی ہے۔ لہٰذا، 1990 کی دہائی میں، لیزر کنفوکل مائیکروسکوپی اور دو فوٹون اکسیٹیشن ٹیکنالوجی کو ملا کر دو فوٹون فلوروسینس مائکروسکوپی وجود میں آئی۔ دو فوٹون جذب کرنے کے عمل کی اتیجیت طول موج عام طور پر 680-1080 nm کی بائیو آپٹیکل ونڈو رینج میں سیٹ کی جاتی ہے، جو خلیات یا جانداروں کو الٹرا وایلیٹ روشنی کے نقصان سے بچاتی ہے اور گہرائی میں داخل ہوتی ہے۔
فی الحال، سب سے زیادہ استعمال ہونے والا دو فوٹون فلوروسینس مائیکروسکوپ فیمٹوسیکنڈ ٹائٹینیم جیم اسٹون لیزر ہے، جو بہت بڑا اور مہنگا ہے، جو مختلف شعبوں جیسے لائف سائنس، کیمسٹری اور طب میں دو فوٹون فلوروسینس مائکروسکوپی کے اطلاق کو محدود کرتا ہے۔ لہٰذا کچھ شعبوں جیسے طبی تشخیص میں، لوگوں نے معیاری روشنی کے منبع کے طور پر کمپیکٹ اور سستی ذیلی نینو سیکنڈ سالڈ اسٹیٹ لیزرز استعمال کرنے کی کوشش کی ہے۔
دو فوٹوون اتیجیت کا بنیادی اصول یہ ہے کہ، جب ایک فلوروسینٹ مالیکیول زیادہ فوٹوون کثافت کے تحت پرجوش ہوتا ہے، تو یہ بیک وقت دو لمبی طول موج کے فوٹونز کو جذب کرتا ہے، اور پھر بے ساختہ فلوروسینٹ فوٹان کو جوش کی چھلانگ اور نرمی کے عمل کے بعد زمینی حالت میں واپس بھیج دیتا ہے۔ روایتی سنگل فوٹوون ایکسائٹیشن فلوروسینس مائیکروسکوپی کے مقابلے میں، دو فوٹوون ایکسائٹیشن فلوروسینس مائیکروسکوپی میں آپٹیکل سگنل جنریشن نان لائنر ہے، جس میں ایکسائٹیشن لائٹ لمبی طول موج، زیادہ چوٹی کی طاقت والی روشنی کا ذریعہ ہے، اور خارج ہونے والے فلوروسینٹ فوٹونز کی طول موج ہے۔ حوصلہ افزائی طول موج کے نصف سے تھوڑا سا طویل.
ٹو فوٹون فلوروسینس مائیکروسکوپی ایک قریب اورکت لیزر لائٹ سورس کا استعمال کرتی ہے، اور اس کی غیر لکیری نوعیت کو کنفوکل یپرچر کی ضرورت نہیں ہے۔ لہذا، کنفوکل مائکروسکوپی کے مقابلے میں، دو فوٹون فلوروسینس مائکروسکوپی کے درج ذیل فوائد ہیں:
- بڑی امیجنگ گہرائی اور کم آپٹیکل نقصان؛
- کسی کنفوکل یپرچر کی ضرورت نہیں ہے، اور فلوروسینس جمع کرنے کی کارکردگی بہت بہتر ہوئی ہے۔
- اعلی مقامی ریزولوشن اور اس کے برعکس؛
- چھوٹی حوصلہ افزائی کی حد، چھوٹا فوٹوٹوکسائٹی اور بلیچنگ؛
- اخراج اور اتیجیت طول موج ایک دوسرے سے دور ہیں، سپیکٹرل اوورلیپ سے گریز کرتے ہوئے؛
